بررسی تولید آنزیم لیپاز مقاوم حرارتی توسط یک سویه باکتریایی بومی ترموفیل، خالص سازی نسبی و تثبیت آن

لیپازها یا تری آسیل گلیسرول آسیل هیدرولازها، آنزیم هایی هستند که واکنش هیدرولیز تری گلیسریدها را در حد فاصل فاز آب-چربی و سنتز استرها را در محیط های با محتوای آب کم طی واکنش های استریفیکاسیون و ترانس استریفیکاسیون کاتالیز می کنند. امروزه لیپازهای میکروبی بویژه لیپازهای باکتریایی مقاوم به حرارت بدلیل پایداری در دماهای بالا و حلال های آلی و توانایی کاتالیز طیف گسترده ای از واکنش های تغییر و تبدیل زیستی، در بیوتکنولوژی بسیار مورد توجه قرار گرفته اند و کاربرد وسیعی در صنایع غذایی و دارویی، صنایع روغنی، سنتز ترکیبات آلی و شوینده ها، تولید بیودیزل و تیمار پساب های روغنی دارند. در این پژوهش، جداسازی و غربال گری سویه های ترموفیل مولد آنزیم لیپاز با نمونه برداری از پساب داغ و روغنی کارخانه چیپس و با استفاده از محیط های غنی سازی و انتخابی مختلف انجام گرفت. سویه برتر sh3 با بیشترین میزان فعالیت لیپاز بر اساس روش مولکولی تعیین توالی 16s rdna و آزمون های بیوشیمیایی شناسایی شد و با آنالیز فیلوژنتیک نشان داده شد که 99% به گونه geobacillus stearothermophilus شباهت دارد. تولید آنزیم لیپاز بوسیله سویه برترsh3 بوسیله ترکیبی از روش یک عامل در یک زمان و رویکرد آماری پلاکت برمن بررسی و بهینه سازی شد و سینتیک رشد باکتری و تولید آنزیم لیپاز در محیط تولید بهینه شده، در مقیاس آزمایشگاهی و در فرمانتور مطالعه شد. خصوصیات آنزیم خام با تأثیر دما و ph های مختلف، یون های فلزی، حلال های آلی، دترجنت ها، سورفاکتانت ها و ترکیبات بازدارنده بر فعالیت و پایداری آن مورد ارزیابی قرار گرفت. دما و ph بهینه فعالیت آنزیم به ترتیب برابر c° 60 و 8 مشخص شد و پایداری قابل ملاحظه ای در دماهای c° 70-50 و ph های 11-8 مشاهده شد. در حضور یون های فلزی سدیم، منگنز، منیزیم و کلسیم، حلال های اتانول، متانول، پنتان، هگزان، ایزواکتان، تترادکان و پنتادکان و دترجنت یونی سدیم دی اکسی کلات فعالیت آنزیمی افزایش پیدا کرد ولی ترکیب فنیل متیل سولفونیل فلوراید (pmsf) فعالیت آنزیمی را به میزان 79% مهار کرد که این امر نشان می دهد لیپاز سویه sh3 به خانواده آنزیم های سرین هیدرولازی تعلق دارد. به منظور تغلیظ و خالص سازی نسبی آنزیم، از روش رسوب دهی با سولفات آمونیوم در غلظت های 90%-20% اشباع و برای نمک زدایی از دیالیز استفاده شد. غلظت بهینه سولفات آمونیوم، غلظت 70% اشباع بدست آمد که باعث خالص سازی آنزیم به میزان 01/18 برابر با فعالیت ویژهu/mg 70/69 و بازده 57/4% گردید. پروتئین های استخراج شده با رسوب دهی، بوسیله الکتروفورز غیر پیوسته ژل پلی آکریل آمید 12% حاوی sds، بررسی شدند و وزن مولکولی تقریبی آنزیم با الکتروفورز بر روی ژل پلی آکریل آمید به روش non-reducing sds-page و زایموگرام برابر 53/61 کیلودالتون تعیین شد. کارایی تثبیت آنزیم نسبی خالص شده نیز با بکارگیری روش ها و حامل های مختلف مورد بررسی قرار گرفت. بیشترین بازده تثبیت و بازده پروتئین کل بارگذاری شده، با تثبیت آنزیم بر روی حامل دی اتیل آمینو اتیل سلولز و بیشترین بازده فعالیت، با تثبیت آنزیم بر روی حامل های کیتوزان و کیتین حاصل شد.